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超凈工作臺(tái)在纖維細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的使用
發(fā)布時(shí)間:2012-06-04 08:52:49   瀏覽:7794

超凈工作臺(tái)在纖維細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的使用

近年來(lái),隨著組織工程及再生醫(yī)學(xué)的迅猛進(jìn)展脂肪干細(xì)胞鑒于其取卡材便利,來(lái)源豐富,低免疫性及多分化潛能等諸多優(yōu)點(diǎn),已成為人們研究的熱門(mén)。但以往的研究大多集中在ADSCs多分化潛能在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,很少關(guān)照ADSCs分泌功能在組織損傷修復(fù)中的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用超凈工作臺(tái)并觀測(cè)研究了ADSCs分泌功能對(duì)成纖維細(xì)胞的生物學(xué)影響,探討ADSCs分泌功能促創(chuàng)面愈合的機(jī)制。


材料和方法

1 主要儀器與試劑:DMEM培養(yǎng)液、胰酶、I型膠原酶、二甲基亞砜、MTT、小牛血清,胎牛血清,annexinV凋亡檢測(cè)試劑盒,Mondel680型酶標(biāo)儀,垂直流超凈工作臺(tái),CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,顛倒顯微鏡,流式細(xì)胞儀。

2 ADSCs分離與培養(yǎng):取腹部外科手術(shù)患者皮下脂肪組織約59,無(wú)菌條件下用剪刀剔除血管及其它組織碎片,用含雙抗的PBS液反復(fù)浸泡沖洗3次,每次約5min,用眼科剪將脂肪組織剪成約lmm3的碎塊,置于0.1%的I型膠原酶中于37℃水浴振蕩消化1h;加入等體積l0%胎牛血清精細(xì)消化后,用200目的細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾,600g離心lOmin,棄去上層脂肪及上清液,沉淀用含l0%胎牛血清培養(yǎng)液重懸接種于培養(yǎng)瓶,置于37℃、5%的C02培養(yǎng)箱中陳規(guī)培養(yǎng)。2天后換液,細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)80%時(shí)傳代培養(yǎng)。

3 3ADSCs培養(yǎng)上清液的制備:選擇生長(zhǎng)良好第3代.ADSCs細(xì)胞接種于75cm2的培養(yǎng)瓶,生長(zhǎng)至80%融合時(shí),換成尢血清培養(yǎng)液DMEM15ml,培養(yǎng)3天后,搜集上清液。上清液經(jīng)O.22μm的濾膜過(guò)濾.分裝,一80。C凍存?zhèn)溆谩?/p>

4 人皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng):用組織塊法培養(yǎng)原代細(xì)胞,置于10%小牛血清培養(yǎng)液中,置于37℃、5%C02培養(yǎng)箱中陳規(guī)培養(yǎng)。

5 成纖維細(xì)胞增殖的測(cè)定:采納MTT法測(cè)定。傳代時(shí)取第3代成纖維細(xì)胞以3×10/孔接種于12孔板,陳規(guī)培養(yǎng)24h后棄上清,設(shè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)比組,實(shí)驗(yàn)組均用ADSC-CM及2%小牛血清配制,對(duì)比組僅用2%小牛血清培養(yǎng)液,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各組加對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液lml,連續(xù)培養(yǎng)3天后,每孔分別加入5g/L的MTT100μl,37℃、5%C02孵育4h后,精細(xì)培養(yǎng):吸棄上清液,每孔加入750μl。二甲基亞楓,連續(xù)孵育lOmin后稍微振蕩使紫藍(lán)色沉淀融解,然后以150μl/孔移動(dòng)至96孔板,每孔反復(fù)5次。用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)下的吸光度值。

 原文來(lái)源:http://www.m.ynotskydive.com/

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